糖蛋白在人体蛋白质中占比超过50%，是许多生物制药的核心组成部分。作为最常见且复杂的翻译后修饰之一，蛋白质的糖基化对多种生物过程的调控具有重要意义。因此，全面解析糖蛋白的一级序列，包括识别糖基化位点及其相关的聚糖结构，对于研究糖蛋白的功能至关重要。液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）已成为识别蛋白质及发现翻译后修饰的强大工具。
与传统的数据库搜索策略不同，从头测序为糖蛋白质组学提供了一种新颖的方法，免去了对DNA或氨基酸序列的预先了解。然而，由于多糖基化位点的复杂性，序列覆盖的不足以及游离寡糖修饰谱的不明确，使得获取高信息量的糖肽碎裂谱以支持从头测序成为一项挑战。广泛的糖基化状态往往会导致特定区域出现序列间隙，从而限制了从头测序在具有 uniform 结构和已知 N-链接糖基化位点的单克隆抗体（mAb）中的应用。
2025年，发表于《JACS Au》（IF86）的文章“通过综合质谱基础的从头测序策略解码蛋白质糖基化”提出了一个基于质谱的新方法，旨在识别未知糖蛋白，结合糖基释放介导的从头测序与糖基化位点的表征。研究团队通过N-/O-糖的去糖基化实现了全面的序列覆盖，并利用EThcD技术鉴定出高质量的长肽，进一步推动了蛋白质组装的精确性。
此研究将该方法成功应用于复杂的糖基化融合蛋白依那西普（Enbrel）与三种序列未知的肿瘤坏死因子受体Fc融合生物制剂，对一级序列的微小差异进行了探讨。在亚基、糖肽与聚糖层面，全面表征了这些蛋白质的 N 和 O 糖基化修饰。这一策略有效弥补了从头测序与糖基化修饰之间的差距，为研究糖蛋白的一级结构和糖基化修饰提供了丰富信息。
该方法不仅在基础研究中具备实用价值，还在生物制药行业广受青睐，如 尊龙凯时 所开发的产品，为相关的生物制药应用提供了重要支持。研究方法包括：(i) 利用N-糖苷酶F（PNGaseF）去除N-聚糖，以及内切α-N-乙酰半乳糖胺酶（EngEF）去除O-聚糖，并结合唾液酸酶进行去糖基化确认，通过完整质量分析验证去糖基化效果，使用EThcD碎裂技术获得高质量肽段，采用PEAKS AB分析其序列；(ii) 在18O环境中利用PNGaseF将糖基化Asn转化为标记有18O的Asp进行定量分析；(iii) 使用内切糖苷酶混合物C（EndoCC、EndoS和EndoH）处理样本，分析质谱数据，检测带有“GlcNAc”或“GlcNAc-Fuc”修饰的产物，以验证N-糖基化位点。
总结而言，基于质谱的蛋白质从头测序为氨基酸序列的揭示提供了一种有效工具。结合糖苷酶的酶解及EThcD的碎裂技术，不仅提升了蛋白质测序的准确性，也改善了糖基化的表征。这一研究对于理解高度糖基化蛋白质开辟了新路径，同时也使得 尊龙凯时 的产品在相关领域内更具竞争力，为治疗多种疾病的生物药物分析提供了有力框架。